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      Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析(一)

      發(fā)布時(shí)間:2019/7/16 6:31:05      閱讀次數:1740

      Western Blot,通常我們在日常交流中說(shuō)的就是簡(jiǎn)稱(chēng)“WB”,中文名稱(chēng)是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應。Western Blot的基本原理是蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠電泳后,按分子量大小順序在分離膠中分離開(kāi)來(lái),通過(guò)轉膜可將膠上蛋白質(zhì)轉移到固相載體(通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜)表面,然后加入一抗去特異性結合膜上蛋白質(zhì),再加入酶或者熒光素標記的二抗,二抗與一抗結合反應后,通過(guò)底物顯色、化學(xué)發(fā)光等方法檢測目的蛋白。Western Blot實(shí)驗一般用來(lái)判斷特定蛋白在樣本中是否表達及粗略分析特定蛋白表達量的高低。



      Western Blot是實(shí)驗室中常見(jiàn)且重要的一種分子生物學(xué)實(shí)驗方法,一次完整的實(shí)驗一般需要兩天時(shí)間,當我們對實(shí)驗結果滿(mǎn)懷期待or充滿(mǎn)信心,也許現實(shí)會(huì )給我們一記響亮的耳光。
       



      下面,小科整理了一些Western Blot 結果常見(jiàn)問(wèn)題:


      /   條 帶 弱   / 

       


      原因分析1:抗原量不足;

      解決方案1:上樣前做蛋白定量,增大上樣量;

      蛋白定量的意義:保證各處理組總蛋白上樣量一致,蛋白總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定,蛋白含量太高會(huì )使條帶扭曲,影響電泳的分辨力;


      原因分析2:蛋白質(zhì)儲存過(guò)程中降解;

      解決方案2:重新制備樣品;


      原因分析3:膜錯誤選擇,轉膜不完全;

      解決方案3:選擇合適的轉印膜:大蛋白(>20KDa)選大孔膜(0.45μm),小蛋白(<20KDa)選小孔膜(0.2μm);優(yōu)化轉膜條件、時(shí)間、電壓。

      轉膜中的要點(diǎn)和建議

      轉膜具體情況 要點(diǎn)和建議
        大分子量蛋白   1)大的蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉移。在轉膜緩沖液里加入0.1%的SDS有助于解除上述現象;
        2)甲醇傾向于從蛋白上移除SDS,因此把甲醇濃度降到10%甚至更少,有助于減少上述沉淀現象,
        適用于大分子量蛋白轉膜;
        3)用4℃濕轉過(guò)夜代替半干法轉膜。
        小分子量蛋白   1)SDS阻礙蛋白和膜的結合,但小分子量蛋白受到的影響更大。若轉膜的蛋白很小,可以考慮去掉
        緩沖液里的SDS;
        2)保持甲醇濃度在20%;
        3)對于非常小的蛋白,不要用半干法。
        膜的方向確定   轉移后剪角做標記,分清正反面;用鉛筆做記號或電泳時(shí)Marker上成非對稱(chēng)的。
        轉膜后背景高   選擇NC膜;另外,雞的抗體傾向于和PVDF膜及一些尼龍膜結合而導致高背景;可以換成NC膜以減
        少背景。
        轉膜時(shí)污染   避免手指觸碰膜,可以用鑷子來(lái)取膜。手指上的油脂和蛋白質(zhì)會(huì )阻礙有效的轉膜,也會(huì )弄臟雜交。
        濾紙的大小   確保濾紙和膜的大小與膠一致。當使用半干法轉膜時(shí),過(guò)多的部分會(huì )阻礙電流穿過(guò)膜。

      原因分析4:抗體量不足;

      解決方案4:增加抗體濃度,注意抗體儲存條件(避免反復凍融);

      抗體的保存和使用:

      1 收到抗體后按要求離心后再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝盒保存;

      2 對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

          2.1 分裝的量以一次實(shí)驗用為好,最好不能少于10ul每份,因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能受到蒸發(fā)及管壁吸附的影響;

          2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來(lái);

      3 大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒(méi)有影響的。

      任何時(shí)候,絕對避免反復凍融。


      原因分析5:抗體孵育時(shí)間不足;

      解決方案5:建議一抗4度孵育過(guò)夜;相對于2小時(shí)孵育,一抗4度過(guò)夜孵育會(huì )顯著(zhù)增加抗體的結合。


      /   條 帶 彎 曲  /   
       

      原因分析1:條帶向上彎曲(︶ 條帶呈笑臉狀):凝膠制備不均勻,中間冷卻不好;
      解決方案1:
      分離膠配好后用水壓線(xiàn),保證水平,配膠緩沖液現用現配,混合均勻后制膠。

      原因分析2:條帶向下彎曲(︵ 條帶呈皺眉狀):可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡;
      解決方案2:制膠架裝配好后,用水檢查是否有空隙再灌膠。
      原因分析3:條帶顯示不均勻,中空:可能凝固太快導致聚合不均勻;
      解決方案3:使用合適的促凝劑,制膠液混合好后及時(shí)灌膠


      /   彌 散  /   

      原因分析1:加樣過(guò)量;
      解決方案1:降低上樣量,推薦每孔上樣20-30ug。
       

      原因分析4:電極不平衡,加樣位置偏斜;
      解決方案4:電泳槽水平放置,配膠時(shí)盡量小心,確保每個(gè)加樣孔完好無(wú)損。
      原因分析2:蛋白降解;
      解決方案2:使用蛋白酶抑制劑。
       
      原因分析3: 樣品溶解不好;
      解決方案3:樣品制備中一定要充分勻漿并超聲裂解。
       

      原因分析5:樣品中含有不可溶顆粒;
      解決方案5:緩沖液配好后過(guò)濾除菌,樣品裂解保證可溶性

      更多實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題留待下次討論,敬請期待。

       

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